由小麦隐匿柄锈菌(Puccinia triticinan)引起的小麦叶锈病是小麦生产中的主要病害之一，选育并合理利用抗叶锈品种是控制该病害流行最经济有效的措施。但由于小麦叶锈菌的高度变异性，特别是大面积种植单一抗性品种，加速了对该病原菌定向选择，促进优势生理小种的形成，最终导致抗锈品种丧失抗性。因此，深入研究小麦抗叶锈性遗传，为抗病育种提供遗传信息，同时科学利用抗病基因，对于该病害的持久控制、安全生产具有十分重要的指导意义。到目前为止，小麦抗叶锈基因遗传和抗病性已经进行了多方面的研究，国际上已发现了90多个抗叶锈病基因，其中有66个抗叶锈基因已被正式命名，统一编号到Lr66 (McIntosh et al., 2009)。

分子标记能够稳定遗传，可反映生物的群体和个体特征，随着现代生物科学的不断发展，一些分子标记技术如RAPD、RFLP、ISSR、SSR和AFLP等已在动植物遗传研究中得到应用。为了更加方便有效的将分子标记应用于作物种质资源和育种研究，人们将筛选到的与目的基因紧密连锁的分子标记转化为更加稳定的STS(sequence-tagged sites)标记、SCAR(sequence-characterized amplified regions)标记或CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)标记。1994年Schachermayr等人(Schachermayr et al., 1994)首先将与抗叶锈基因Lr9共分离的RAPD分子标记转化成了STS标记， Feuillet等人(Feuillet et al., 1995)于1995年分别将与Lr1共分离的RFLP分子标记及与Lr10紧密连锁的的RFLP分子标记转化成了STS标记；2001年Prins等人(Prins et al., 2001)将Lr19的AFLP分子标记也转化成了更为稳定的STS标记。

分子标记辅助选择(molecular marker-asisted selection, MAS)是利用与抗病基因紧密连锁的分子标记追踪抗病基因。其最大的应用方面是将分散在不同抗病材料中的有利基因累加到一个品种中，在基因聚合工程中能对每代植株开展早期和大范围的选择，进而减少育种代次，促进和加速育种过程。刘志勇等(刘志勇, 2000)已利用PCR方法对抗叶锈基因Lr9和Lr24进行了分子标记的诊断，证明了PCR标记在小麦抗病基因的标记辅助选择和基因累加中有很好的潜力。本人前期研究(刘莉, 2008)验证了Lr24_{STS-J9-310 bp}，Lr35_{Sr39-900 bp}这两个分子标记在54个近等基因系中的稳定性及特异性。魏新燕等(魏新燕, 2004)分别用试验表明了Lr24_{STS-J9-310 bp}，Lr35_{Sr39-900 bp}分子标记在不同的遗传背景下仍能作为稳定可靠的辅助标记。因此寻找与验证出更多的与抗病基因紧密连锁的具有较好特异性的分子标记，在育种实践中开展标记辅助选择和抗病基因累加，对于促进抗源材料农艺性状的不断改进，实现小麦抗叶锈病的抗源多样化，具有十分重要的意义。

本实验选用了以Thatcher为背景的54个NILs为材料，对已筛选到的与抗病基因Lr1、Lr9、Lr10和Lr19连锁的STS标记进行检测和验证，进一步确定这几个分子标记可用于辅助选择的准确性，从而为抗病品种的筛选和抗病品种的改良及培育奠定基础。

1结果与分析
1.1 Lr1 的PCR-STS结果
将与Lr1连锁的STS_Lr1-PTAG引物对Thatcher和以Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈病近等基因系植株DNA进行PCR扩增，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳(图1)。从图中可以看出，除了泳道5、31和泳道34以外，其他泳道所对应的植株DNA中均扩增出了片段大小为560 bp的条带，说明引物STS_Lr1-PTAG除未在TcLr3、TcLr28和TcLr27+31(有芒)中表达外，在其他50个不含有Lr1植株DNA中全得到表达，如果用此引物进行Lr1基因筛选，结果将不能说明被检测植株确切含有Lr1抗叶锈基因。

图1 Lr1的PCR-STS扩增结果 Figure 1 Amplification products of marker STS specific to L1 gene 注: M: DL2000 marker; 1-54: 顺序为表1所示顺序, 箭头所指为560 bp Note: M: DL2000 marker; 1-54: reforent Thatcher near-isogenic lines (from No. 1 to No. 54 showing in Table 1), Arrow shows the 560 bp band

1.2 Lr9 的PCR-STS结果
用与春小麦Thatcher为背景的54个近等基因系材料对Lr9的STS_Lr9-J13标记进行检测，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳(图2)，结果表明与Lr9连锁的STS_Lr9-J13标记成功地从近等基因系中扩增出与报道大小相同的1 100 bp的DNA片段，且该片段仅在含有Lr9植株DNA中得到表达，重复试验结果相同，证明与Lr9紧密连锁的STS_Lr9-J13标记的稳定可靠，且特异性较好，可作为分子辅助选择标记用于分子育种。

图2 Lr9的PCR-STS扩增结果 Figure 2 Amplification products of marker STS specific to Lr9 gene 注: M: DL2000 marker; 1-54: 顺序为表1所示顺序, 箭头所指为1 100 bp Note: M: DL2000 marker; 1-54: reforent Thatcher near-isogenic lines(from No1 to No54 showing in Table1), Arrow shows the 1 100 bp band

1.3 Lr10的PCR-STS结果
用与Lr10连锁的STS引物在以春小麦Thatcher为背景的54个近等基因系材料DNA中进行扩增，扩增结果琼脂糖凝胶电泳监测表明(图3)，第10泳道的TcLr10植株DNA中扩增出了一条片段大小为310 bp的条带，在其他52个近等基因系材料和春小麦Thatcher中未扩增出任何片段，且该片段大小与报道相同，证明该STS标记具有选择特异性。

图3 Lr10的PCR-STS扩增结果 注: M: DL2000 marker; 1-54: 顺序为表1所示顺序, 箭头所指为310 bp Figure 3 Amplification products of marker STS specific to Lr10 gene Note: M: DL2000 marker; 1-54: reforent Thatcher near-isogenic lines (from No1 to No54 showing in Table1), Arrow shows the 310 bp band

1.4 Lr19的PCR-STS结果
用54个供试小麦基因组DNA作为模板，用与Lr19连锁的STS_Lr19-Gb引物在Bio-metraPCR扩增仪中进行扩增，重复试验三次，扩增结果如图4所示，在54个基因组DNA中，只有位于22泳道的TcLr19植株DNA中扩增出了一条130 bp的片段，片段大小同报道相同，说明STS_Lr19-Gb标记具有单一连锁特异性，可作为分子辅助选择标记用于目的基因的选择。

图4 Lr19的PCR-STS扩增结果 注: M: DL2000 marker; 1-54: 顺序为表1所示顺序,箭头所指为130 bp Figure 4 Amplification products of marker STS specific to Lr19 gene Note: M: DL2000 marker; 1-54: reforent Thatcher near-isogenic lines (from No1 to No54 showing in Table1), Arrow shows the 130 bp band

2讨论
传统小麦基因鉴定方法如系谱推导、单体分析基因定位、抗谱分析、寄主与病原互作产生的侵染型分析等方法，技术要求较高，影响因素多，实际操作有局限性，尤其在亲本遗传背景不清楚或鉴定和筛选含两个以上基因的材料时尤为复杂。利用与特定基因紧密连锁的分子标记追踪基因，可使目的基因的鉴定摆脱上述因素带来的困难且结果更加准确可靠。分子标记辅助育种可在种子或幼苗期鉴定，利用与目的基因紧密连锁、稳定单一诱到的分子标记进行品种的筛选及聚合育种，能够大大缩短世代间隔及育种年限，提高基因回交转移速度的效率。

本研究将近等基因系材料扩大到54个，从而在更广单一抗性品种范围内验证了STS标记的稳定性与特异性。验证结果表明与小麦抗叶锈基因Lr9、Lr10、Lr19连锁的STS标记特异性较好且稳定可靠，扩增产物片段大小分别为Lr9-1100 bp、Lr10-310 bp、Lr19-130 bp。验证结果说明了Lr9-1100 bp、Lr10-310 bp和Lr19-130 bp分子标记可以用于小麦抗叶锈基因的分子标记辅助选择育种，为分子标记辅助选择和抗病育种提供了理论和技术支持，进一步说明特异PCR产物的扩增是可用于自动筛选抗叶锈基因的简便且稳定可靠的方法之一。

Lr1的STSPTAG分子标记的扩增产物除在其亲本出现外，在其它的53个近等基因系中也都扩增出了与亲本同样大小的条带，说明抗叶锈基因Lr1的STSPTAG分子标记无特异性，不能用于分子标记辅助选择育种，需要寻找与其连锁的其它特异性引物或寻找更好的其它方法来研究。

3材料与方法
3.1实验材料
供试的53个以春小麦Thatcher为遗传背景的近等基因系及品种Thatcher种子提供单位及扩增、电泳排序参照(刘莉, 2008, 私人通讯)。

3.2实验方法
3.2.1 DNA提取
参照(刘莉, 2008, 私人通讯)一文中所用方法进行DNA提取及PCR扩增、扩增产物电泳。

3.2.2 引物序列
根据报道，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成与Lr1、Lr9、Lr10、Lr19连锁的STS标记的引物序列(表1)。

表1 STS或SCAR的引物序列 Table1 Primer sequences of STS or SCAR markers for leaf rust resistance genes

3.2.3 PCR扩增
PCR扩增所用仪器、试剂、反应体系及琼脂糖凝胶电泳所用仪器、试剂等参照(刘莉, 2008, 私人通讯)。不同引物组合的PCR反应程序见表2。

表2 不同引物组合的PCR反应程序 Table 2 PCR amplification programs for different primer combinations used in analyses

作者贡献
刘莉和陈云芳是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；杨文香参与实验设计，试验指导及试验结果分析；刘大群是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家公益性行业(农业)科研专项(200903035)和国家自然基金(30771391)资助。作者感谢河北农业大学张汀老师及闫红飞老师在本实验过程中的技术支持和有益的建议。

参考文献 
Feuillet C., Schachermayr G., and Keller B., 1995, Molecular cloning of a new receptor-like kinase gene encoded at the Lr10 disease resistance locus of wheat, The Plant Journal, 11(1): 45-52 doi:10.1046/j.1365-313X.1997.11010045.x PMid:9025301

Feuillet C., Messer M., and Schacheermayr G., 1995, Genetic and physical characterisation of the Lr1 leaf rust resistance locus in wheat, Mol. Genet, 248: 553-562 doi:10.1007/BF02423451

Liu L., Chen Y.F., and Liu H.L., Yang W.X., Zhang T., and Liu D.Q., 2008, Verification of sts molecular markers for leaf rust resistance genes Lr24 and Lr35 in near-isogenic lines of wheat cv. thatcher, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 6(3): 471-474 (刘莉, 陈云芳, 刘华梁, 杨文香, 张汀, 刘大群, 2008, 小麦抗叶锈基因Lr24、Lr35 的STS、SCAR标记在近等基因系(NILs)上的特异性验证, 分子植物育种, 6(3): 471-474)

Liu Z.Y., Wang X.L., and Ni Z.F., 2000, Molecular Marker Assisted Selection (MAS) of Leaf Rust (Puccinia recondita f. sp. tritici) Resistance Genes, Lr9 and Lr24, in Wheat, Nongye Shengwu Jishu Xuebao (Journal of Agricultural Biotechnology), 8(1): 13-16 (刘志勇, 王晓玲, 倪中福等, 2000, 小麦抗叶锈基因Lr9、Lr24的分子标记辅助选择研究, 农业生物技术学报, 8(1): 13-16)

McIntosh R.A., Dubcovsky J., Rogers W.J., Morris C., Appels R., and Xia X.C., 2009, Catalogue of gene symbols for wheat: 2009 supplement, http://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/macgene/supplement2009

Prins R.J., Groene W.Z., and Marais G.F., 2001, AFLP and STS tagging of Lr19, a gene conferring resistance to leaf rust in wheat, Thero .Appl. Genet, 103(4): 618-624 doi:10.1007/PL00002918

Schachermayr G., Siedler H., and Gale M.D., 1994, Identification and localization of molecular markers linked to the Lr9 leaf rust resistance gene of wheat, Theor. Appl. Genet, 88: 110-115 doi:10.1007/BF00222402

Wei X.Y., Yang W.X., and Liu D.Q., 2004, MAS for Leaf Rust Resistance Gene Lr35 in 150 Wheat Cultivars, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia Agricultural Sinica), 37(12): 1951-1954 (魏新燕, 杨文香, 刘大群等, 2004, 150个小麦品种(系)抗叶锈基因Lr35分子检测, 中国农业科学, 37(12): 1951-1954)